1. 如何防止RNA降解？

     1） 逆转录qPCR时，提取RNA是关键，需琼脂糖凝胶电泳检测是否为高质量RNA（纯度和完整性）。

     2）整个操作过程需使用无RNA 酶的枪头、EP 管等耗材。
     3）逆转录过程中要谨防 RNA酶的污染，加入RNA酶抑制剂。
     4）逆转录实验应全程在冰上操作完成，操作过程应避免 RNase 污染。

    2. 如何提高 qPCR 反应的灵敏度与特异性？

     1）RNA 模板中不应含有扩增反应抑制剂。
     2）使用适量的模板 RNA ，模板量太多会降低特异性，太少会导致扩增不出条带或条带太弱。
     3）若模板中有二级结构，可通过提高逆转录反应温度来提高扩增效果。

    3. 如何检测RNA逆转录成功与否？

     1）内参法：理论上，逆转录的cDNA是长度不同的DNA片段，所以电泳条带应该均匀分布在泳道上，如果RNA丰度低，电泳检测也可能无产物，这种情况通过PCR扩增内参基因，如果有扩增产物，cDNA的质量基本上可以保证(少数情况下：如目的基因片段过长，可能会有例外)。

     2）已知基因扩增法：如果有已知以此模板扩出来的基因，可以用此基因的引物验证。能扩增出内参，不一定就说明cDNA没有问题，因为内参在cDNA中丰度高，容易扩增。如果cDNA因为各种原因导致部分降解，则会大大影响低丰度的目的基因的PCR结果，而内参因为是高丰度基因，扩增很可能不受影响。

    4. 逆转录产物中存在gDNA对后续qPCR实验有何影响？

      当cDNA产物中混有gDNA时，cDNA和gDNA在qPCR反应时会被同时扩增，无法区分荧光信号是来自于cDNA还是gDNA，因此定量结果可能会存在偏差。特别是低表达量的基因，本身的扩增信号低，Ct值大，更加容易受到gDNA污染的影响。本产品在逆转录过程中加一步gDNA去除的步骤，能够有效降低gDNA污染的影响，增加实验的可信度。

    5. 如何确定合适的RNA量进行逆转录？

      先开展预实验将RNA浓度进行梯度稀释后，选取CT值落在15-30的RNA含量。