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产品概述
本试剂盒为qPCR反转录专用。试剂盒中包含优化的4×gDNA去除及5×反转录预混液。其中的4×gDNA Remove Mix能有效清除RNA样本中残留的gDNA，从而保证后续qRT-PCR实验的定量结果更加准确可靠。而优化后的5×HP qRT Master Mix合成能力强、灵敏度高，广泛适用于动植物及微生物RNA的逆转录反应，产物兼容染料法和探针法qPCR。
产品特点&优势
—通用性强：基因适用范围广，如细胞、动物组织、植物组织RNA等；
—灵敏度高：本产品可转录低至10pg含量RNA，保证低浓度cDNA模板目的基因的扩增；
—效率优异：在将模板浓度进行梯度稀释后，扩增CT值良好；
—杂质耐受程度高：对于RNA提取过程中乙醇、异丙醇等杂质残留耐受程度高；
—可靠性稳定：本产品对于gDNA去除效果明显（50%gDNA残留可去除），不损伤RNA样本，保证后续qPCR实验结果的可靠性，减少实验误差。
产品组成
*1.含Buffer、dNTP、RT酶、RNase inhibitor、Random primers/Oligo(dT)20 VN primer mix。
*2.除不含RT酶外，其余成分与5×HP qRT Master Mix相同，用于配制No RT阴性对照。
操作流程
1. gDNA去除体系配制
*1.基因表达量低时可增加RNA用量，但不建议超过5µg用量。
1. 用移液器吹打混匀。42℃孵育2 min。
2. 配制逆转录反应体系
在第一步的反应液中直接加入4 µl的5×HP qRT Master Mix，移液枪轻柔地吹打混匀。
配制体系如下：
*2.将5×HP qRT Master Mix替换为NRT预混液可逆转录阴性对照反应，用于检验RNA模板中是否有基因组DNA残留。（可选步骤）
反应程序
*1：对于富含复杂结构和高GC的模板，可将温度调整至50℃，有助于提高反转录效率。
保存条件
-30~-15℃保存，干冰/-20℃运输。
实验案例
1.逆转录效率测试
选取293T细胞提取RNA，将RNA浓度10倍梯度稀释，最低模板浓度梯度为10pg，分别用YoungGEN#RT201和Supplier V产品逆转录，采用内参基因（β-actin）进行后续qPCR实验，实验结果如上图所示。
2.常见杂质耐受程度的影响
分别用乙醇和异丙醇进行耐受度测试，选择5%、10%、20%杂质浓度进行逆转录，扩增结果对比如上图所示。
1. 如何防止RNA降解？
1） 逆转录qPCR时，提取RNA是关键，需琼脂糖凝胶电泳检测是否为高质量RNA（纯度和完整性）。
2）整个操作过程需使用无RNA 酶的枪头、EP 管等耗材。
3）逆转录过程中要谨防 RNA酶的污染，加入RNA酶抑制剂。
4）逆转录实验应全程在冰上操作完成，操作过程应避免 RNase 污染。
2. 如何提高 qPCR 反应的灵敏度与特异性？
1）RNA 模板中不应含有扩增反应抑制剂。
2）使用适量的模板 RNA ，模板量太多会降低特异性，太少会导致扩增不出条带或条带太弱。
3）若模板中有二级结构，可通过提高逆转录反应温度来提高扩增效果。
3. 如何检测RNA逆转录成功与否？
1）内参法：理论上，逆转录的cDNA是长度不同的DNA片段，所以电泳条带应该均匀分布在泳道上，如果RNA丰度低，电泳检测也可能无产物，这种情况通过PCR扩增内参基因，如果有扩增产物，cDNA的质量基本上可以保证(少数情况下：如目的基因片段过长，可能会有例外)。
2）已知基因扩增法：如果有已知以此模板扩出来的基因，可以用此基因的引物验证。能扩增出内参，不一定就说明cDNA没有问题，因为内参在cDNA中丰度高，容易扩增。如果cDNA因为各种原因导致部分降解，则会大大影响低丰度的目的基因的PCR结果，而内参因为是高丰度基因，扩增很可能不受影响。
4. 逆转录产物中存在gDNA对后续qPCR实验有何影响？
当cDNA产物中混有gDNA时，cDNA和gDNA在qPCR反应时会被同时扩增，无法区分荧光信号是来自于cDNA还是gDNA，因此定量结果可能会存在偏差。特别是低表达量的基因，本身的扩增信号低，Ct值大，更加容易受到gDNA污染的影响。本产品在逆转录过程中加一步gDNA去除的步骤，能够有效降低gDNA污染的影响，增加实验的可信度。
5. 如何确定合适的RNA量进行逆转录？
先开展预实验将RNA浓度进行梯度稀释后，选取CT值落在15-30的RNA含量。
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